2023年9月7日，沈张飞博士所在的俄亥俄州立大学傅天民团队利用一系列冷冻电镜和生物化学手段，正式在《Nature》发文完整揭示了一种细菌短Argonaute（Ago）蛋白活化的分子机理。傅天民教授为本文通讯作者，沈张飞博士后和杨晓媛博士生为论文的共同第一作者。
Ago蛋白广泛存在于细菌、古菌和真核生物中，参与调控许多重要的生理过程。最广为人知的是真核生物Ago (eAgo)蛋白可以参与降解或抑制互补配对的靶向RNA，从而影响基因表达，称之为RNA干扰 (RNAi)。揭示RNAi分子机理的两位科学家获得了2006年的诺贝尔生理医学奖。细菌Ago（pAgo）蛋白主要分为长pAgo和短pAgo蛋白。其中，研究较多的长pAgo结构域和eAgo结构域非常相似，主要使用RNA或者DNA作为靶向序列参与清除入侵的核酸（噬菌体或质粒）。然而长久以来，占已知pAgo大多数的细菌短pAgo（约占Ago家族58%）的研究甚少。
去年，荷兰瓦赫宁根大学的Daan Swarts团队率先研究了一种短pAgo蛋白与伴侣蛋白（TIR-APAZ）组成的异源二聚系统，即SPARTA，可以在单链RNA引导下结合靶向单链DNA后形成四聚体，从而激活伴侣蛋白中的TIR结构域的NAD(P)+酶活性，进而消耗细菌体内的NAD(P)+，最后导致细菌死亡。该过程引发的是流产性感染，是一种常见于细菌的通过牺牲侵染细菌个体达到保护群体的免疫手段。Swarts团队的发现部分揭示了细菌短Ago蛋白介导的生物学功能，但未能揭示其分子作用机理。
沈张飞博士等率先通过解析了分辨率为3.1 Å的未激活状态下的SPARTA单体结构来阐明了其基本结构组成。通过与其他Ago相比，他们发现SPARTA独特的APAZ结构域有一个C末端基序，可以起到抑制SPARTA的过度激活。接着解析了3.26 Å的SPARTA结合核酸的单体结构，并阐明了SPARTA识别RNA引导链和DNA靶向链的分子基础，发现短pAgo（MID结构域）中存在两个特殊的Loop环，导致RNA引导链和DNA靶向链互补配比从第三位开始，晚于其他已知的Ago蛋白。
接着他们解析了分辨率为2.7 Å的活化状态下的四聚体SPARTA结构，结构像一个美丽的蝴蝶。四个SPARTA形成一个不对称的四聚体，并存在两类相互作用：两个Ago（MID-MID结构域）介导的相互作用和四个TIR结构域形成聚集体之间的相互作用。其中，TIR四聚体中又有两种相互作用界面：二聚化作用界面和四聚化作用界面。最后，他们又解析了2.9 Å的四聚体SPARTA结合NAD+分子的结构，意外的发现有两个NAD+分子分别结合在TIR结构域两个二聚化作用界面上。还通过进一步的生化手段验证了四聚化的TIR结构对于激活NAD+的催化活性是必须的。
该研究通过捕捉SPARTA的未激活结构，结合核酸的单体结构和二聚体结构，以及活化的四聚体结构，详细揭示了SPARTA的层级激活机理。首先，未激活状态下的SPARTA单体结合RNA引导链/DNA靶向链后，Ago蛋白上的MID结构域发生构象变化。接着，两个结合互补核酸链的SPARTA单体相互靠近后，由于两个MID结构域之间存在的形状和电荷的互补，其中一个结构域会和另一个结构域发生相互作用，形成一个对称的二聚体。紧接着，在对称的二聚体中，APAZ连接的TIR结构域也由于电荷和形状的互斥反应，其中一个TIR结构域发生近约180度的翻转，形成不对称的二聚体。最后两个不对称的SPARTA二聚体再通过TIR相互作用变为四聚化激活状态。
图1.SPARTA的图示激活过程
综上，本研究首次从分子水平上描述了短pAgo家族SPARTA的激活机制，为理解其他短Ago活化机理奠定了基础，也为进一步改造SPARTA成为核酸检测或生化治疗工具提供了理论支持。
沈张飞是动科学院时连根教授实验室2020届博士毕业生，2021年3月前往美国开展博士后训练，现主要利用结构生物学结合一系列生化手段研究微生物与免疫感染，博士后期间已经以第一作者和共同第一作者在Nature, Nature Structural & Molecular Biology, Nature Communications, Cell Calcium等杂志发表或接收多篇论文，目前还有多篇论文在修改或投稿准备中。
论文链接：www.nature.com/articles/s41586-023-06456-z
（沈张飞供稿）
科研科
2023年9月13日